Серологическая диагностика туляремии

Серологическая диагностика туляремии

Род Francisella Основной вид — F.tularensis — возбудитель туляремии — природноочаговой инфекции, резервуаром которой являются многие виды преимущественно мелких диких позвоночных животных (представителей четырех основных семейств — мышевидных, заячьих, беличьих и тушканчиковых). На территории России основными носителями являются мышевидные грызуны — водяные крысы, ондатры, различные виды полевок. Помимо F. tularensis к этому роду относится F. novicida, патогенность которой для человека не доказана.

Морфология.Франциселлы — мелкие кокковидные или элипсоидные полиморфные палочки, неподвижные, грамотрицательные, не образующие спор.

Культуральные свойства.Строгие аэробы, оптимум температуры около +37 градусов Цельсия, pH- близкая к нейтральной. Культивируют на агаровых и желточных средах сложного состава с добавлением цистеина, глюкозы, крови. Рост медленный. Образуют мелкие колонии, напоминающие капельки росы, круглые с ровным краем, выпуклые, блестящие, с голубоватым отливом.

Биохимические свойства. Слабо ферментируют до кислоты без газа некоторые углеводы (глюкозу, мальтозу, левулезу, маннозу), образуют сероводород. Туляремийный микроб по вирулентности для кроликов и биохимическим особенностям, а также географическому распространению разделен на подвиды (эколого — географические расы):

— голарктическую (не ферментирует глицерин, не имеет фермента цитруллинидазы, маловирулентен для кроликов и человека, распространен в Евразии);

— неоарктическую (ферментирует глицерин, не имеет цитруллинидазы, более вирулентен для кроликов и человека, распространен в Северной Америке);

— среднеазиатскую (ферментирует глицерин, имеет цитруллинидазу, мало вирулентен, вариант mediasiatica выявляют в Средней Азии, вариант japonica — в Японии).

По отношению к эритромицину голарктическая раса делится на два типа — устойчивый и чувствительный.

Антигенные свойства.F.tularensis в S (вирулентной) форме имеет два основных антигенных комплекса — О антиген (обнаруживает сходство с О — антигенами бруцелл) и Vi (капсульный) антиген. Диссоциация SàR приводит к утрате капсулы, вирулентности и иммуногенности.

Эколого-эпидемиологические особенности. На территории России выделено 7 основных ландшафтных типов природных очагов туляремии: пойменно-болотный, луго-полевой, степной, лесной, предгорно-ручьевой, тундровый и тугайный (пойменно-пустынный) со своими основными хозяевами возбудителя и эколого-эпидемиологическими особенностями. Человек очень чувствителен к туляремийному микробу, минимальная инфицирующая доза — одна микробная клетка. Животные по чувствительности к этому микроорганизму разделены на четыре группы. Особое значение в условиях Западной Сибири имеют водяные крысы и ондатры. Заражение человека может происходить путем контакта с грызунами или инфицированными ими предметами, алиментарным путем (инфицированные грызунами вода и пищевые продукты), воздушно-пылевым путем, трансмиссивно (иксодовые клещи и другие кровососы).

Клинико-патогенетические особенности.

Возбудитель туляремии является внутриклеточным паразитом. Его вирулентность обусловлена:

— капсулой, угнетающей фагоцитоз;

— нейраминидазой, способствующей адгезии;

— аллергенными свойствами клеточной стенки;

— способностью размножаться в фагоцитах и подавлять их киллерный эффект;

— наличием рецепторов к Fc- фрагменту IgG, подавлять активность систем комплемента и макрофагов.

Франциселлы проникают в организм через кожу и слизистые глаз, рта, дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта. Г.П. Руднев (1970) предложил в патогенезе туляремии выделить следующие стадии:

1. Внедрения и первичной адаптации возбудителя.

2. Лимфогенного заноса.

3. Первичных регионарно-очаговых (туляремийный бубон) и общих реакций.

4. Гематогенных матастазов и генерализации.

5. Вторичной полиочаговости.

6. Реактивно-аллергических изменений.

7. Обратного метаморфоза и выздоровления.

В ряде случаев процесс может ограничиваться первыми тремя фазами.

Основными клиническими формами туляремии являются язвенно-бубонная (ульцерогландулярная), глазо-бубонная (окулогландулярная), легочная, абдоминальная, генерализованная, другие формы (в т.ч. ангинозно-гландулярная), неуточненная.

Бактериологические методы диагностики туляремии для человека имеют дополнительное значение и не всегда эффективны, что определяется биологическими особенностями возбудителя и особенностями инфекции у человека (малая концентрация возбудителя в органах и тканях).

Биопроба является намного более эффективным методом диагностики. Материал от больного (пунктат бубона, выделения с конъюнктивы, пленка с миндалин, мокрота и др.) используют для заражения лабораторных животных (чаще белых мышей), из органов павших животных делают высевы на питательные среды, культуру идентифицируют по совокупности следующих признаков:

а) морфология клеток и грамотрицательная окраска;

б) рост на желточной среде и специальных средах и отсутствие роста — на простых мясо-пептонных средах;

в) специфическое свечение в реакции иммунофлюоресценции (МФА);

Читайте также:  Биопрепараты для людей

г) агглютинация культуры туляремийной сывороткой;

д) способность вызывать гибель белых мышей и морских свинок с характерными патологоанатомическими изменениями в органах и выделением чистой культуры.

Бактериологические методы и биопробы могут выполняться только специализированными лабораториями, имеющими разрешение на работу с возбудителем туляремии (2 группа патогенности). В качестве метода выявления туляремийного микроба может использоваться МФА, реакция нейтрализация антител — РНАТ, в качестве дополнительного — ПЦР.

Наибольшее значение в лабораторной диагностике туляремии имеют серологические методы — РА, РПГА. Обязательно исследование парных сывороток крови. Дополнительными серологическими методами являются ИФА, РНИФ.

Аллергодиагностика (проба с тулярином — туляремийным аллергеном) чаще используется для оценки естественного и вакцинального иммунитета. ГЗТ развивается на первой неделе болезни, а также после вакцинации и сохраняется несколько лет. У больных накожные и внутрикожные туляриновые пробы не рекомендуются в связи с возможностью ухудшения состояния больного. Могут применяться методы аллергодиагностики in vitro — реакция лейкоцитолиза, РТМЛ и др.

На неблагополучных по туляремии территориях применяют живую туляремийную вакцину. Иммунитет длительный, проверяется с помощью пробы с тулярином. С помощью этой пробы отбирают контингенты на вакцинацию и ревакцинацию.

Диагностика туляремии. Принципы микробиологической диагностики возбудителей туляремии. Тулярин. Лечение туляремии и профилактика туляремии.

Наиболее достоверные результаты даёт выделение возбудителей туляремии. Материал для исследований возбудителей туляремии: пунктат из бубонов, отделяемое конъюнктивы, мокрота, слизь из зева, кровь, испражнения, ткани погибших грызунов).

Работа с возбудителем туляремии сопряжена с угрозой заражения персонала и разрешена только в лабораториях особо опасных инфекций. Как правило, выделить возбудитель из клинического материала невозможно. Для этого прибегают к биопробе на мышах или морских свинках, подкожно заражая их исследуемым материалом.

Затем проводят посев крови и тканей животных для выделения чистой культуры туляремии и изучения её морфологических, биохимических и антигенных свойств.

Для окончательной идентификации туляремии проводят заражение чистой культурой белых мышей. Для экспресс-диагностики Аг возбудителя туляремии в мазках применяют РИФ.

AT к туляремии в сыворотке больного определяют в РА с туляремийньм диагностикумом; положительной считают видимую глазом реакцию при разведении сыворотки 1:100 и больше (положительные результаты на первой неделе выявляют у 12,5% больных, на четвёртой — у 93,2%). Для ранней диагностики эффективна кожная аллергическая проба.

В качестве Аг применяют тулярин — взвесь бактерий, убитых нагреванием до 70 °С. Препарат вводят внутрикожно в объёме 0,1 мл (100 млн микробных тел), учёт проводят через 24—48-72 ч. Следует помнить, что проба остаётся положительной и у лиц, переболевших туляремией.

Лечение туляремии

Возбудитель туляремии — факультативный внутриклеточный паразит, что снижает эффективность антибактериальных средств. Препараты выбора — аминогликозиды, тетрациклины и левомицетин.

Профилактика туляремии

Профилактика туляремии затруднена вследствие широкого распространения Francisella tularensis в природе. Мероприятия направлены на оздоровление природных очагов инфекции (уничтожение грызунов, клещей и т.д.), обеспечение санитарного состояния источников воды, складов продовольствия и т.д., а также санитарно-просветительную работу среди населения. Население эндемичных районов и сотрудников специализированных лабораторий иммунизируют живой ослабленной вакциной.

а) Наиболее распространенным и вместе с тем вполне точным методом серологической диагностики туляремии является реакция агглютинации (РА). Она служит для установления диагноза у больного или переболевшего (ретроспективный диагноз) и может быть использована при изучении иммунологического состояния привитых против туляремии. Обнаружение агглютининов у больного туляремией обычно отмечается через 10-15 дней, при этом агглютинационный титр сыворотки в этот период составляет 1:50-1:100, но далее быстро нарастает и на 4-6-й неделе болезни достигает 1:400-1:800, реже 1:1600 и выше.

По достижении максимальных показателей агглютинационный титр сыворотки затем медленно снижается и через 6-12 месяцев составляет 1:100-1:400, а позднее падает до 1:10-1:50 и на этом уровне может удерживаться в течение многих лет. Длительность сохранения агглютининов делает возможным использование РА для ретроспективного диагноза.

У привитых против туляремии агглютинины обнаруживаются через 2-3 нед., достигают через 4-6 нед. максимальных титров 1:160-1:320, реже выше, затем снижаются до 1:10-1:40 и обычно выявляются в течение 5-7 лет после вакцинации.

Читайте также:  Новые методы лечения болезни паркинсона

Антигеном для РА служит туляремийный диагностикум, представляющий собой убитую формалином взвесь туляремийных бактерий вакцинного штамма. В 1 мл препарата содержится 25 млрд, туляремийных бактерий. Для постановки РА туляремийный диагностикум предварительно разводят 0,9%-ным раствором хлорида натрия (pH 7,0-7,2) в 5 раз до концентрации 5 млрд, туляремийных бактерий в 1 мл.

Учет результатов РА производят через 18-24 ч невооруженным глазом. Оценку реакции осуществляют на основании степени прозрачности надосадочной жидкости в пробирках, количества и характера осадка микробной массы (агглютината).

Агглютинационный титр сыворотки учитывают по последнему разведению, которое дало вполне четкую реакцию (не менее трех плюсов).

При серологической диагностике туляремии у человека диагностическим считается титр 1:100 и выше, однако обязательно должно быть прослежено его нарастание. При отрицательной или сомнительной реакции, а также при положительной реакции в низких разведениях сыворотки у подозрительных на туляремию больных рекомендуют повторить исследование сыворотки через 7-10 дней. Нарастание титра сыворотки в 2-4 раза и выше свидетельствует о свежем случае туляремии и подтверждает диагноз.

Реакцию агглютинации можно ставить в микрообъемах, используя для этого сыворотку или плазму крови, взятую из пальца руки. Диагностикум для реакции микроагглютинации готовят из убитой культуры вакцинного штамма туляремийного микроба, которую окрашивают гематоксилином. Реакцию микроагглютинации ставят в полистироловых пластинах микротитратора Такачи. Для этого в ряд лунок полистироловой пластины микротитратора Такачи вносят 50 мкл физиологического раствора (pH 7,0-7,2).

Затем при помощи титратора с головкой объемом 50 мкл раститровывают исследуемую сыворотку, предварительно разведенную 1:5 (или неразведенную плазму крови) и добавляют в каждую лунку равный объем (50 мкл) цветного, окрашенного гематоксилином диагностикума. При этом происходит разведение сыворотки в 4 раза (с 1:5 до 1:20), и получают следующий ряд разведений сыворотки 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 и т.д. Пластины тщательно встряхивают и помещают на 2 ч в термостат при температуре 37°С, затем выдерживают 12-18 ч при комнатной температуре. В лунках с положительным результатом антиген выпадает на дно в виде «зонтика» (агглютинат), а в случае отрицательного результата — в виде «пуговки».

Титры реакции микроаттлютинации, как правило, совпадают или на одно разведение ниже титров РА, выполненной макрометодом.

б) Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) является чувствительным методом серологической диагностики и используется как для ранней, так и ретроспективной диагностики, а также для определения иммунологического состояния привитых. У больных туляремией гемагглютинины обычно обнаруживаются в конце первой или на второй неделе заболевания. Через 1—1,5 мес. титры РНГА достигают максимальных показателей (1:10 000-1:20 000, реже выше), после чего снижаются и на уровне 1:100-1:200 сохраняются длительное время.

У привитых антитела также обнаруживаются постоянно, однако, в более низких титрах, не превышающих 1:2000-1:5000 через 1-1,5 мес. после вакцинации, и сохраняются в течение нескольких лет на низком уровне 1:20-1:80. Обычно гемагглютинационный титр сыворотки превышает таковой агглютинационный. Особенно это выражено у больных в острый период болезни или у привитых в короткие сроки после вакцинации. При ретроспективном обследовании переболевших и привитых в отдаленные сроки резких различий в титрах РА и РИГА не отмечается.

Антигеном для постановки РИГА служит туляремийный эритроцитарный диагностикум (антигенный). Препарат представляет собой формал и визированные эритроциты барана, сенсибилизированные туляремийным антигеном; выпускается в жидком и сухом виде. Жидкий препарат — 10% взвесь эритроцитов в 10%-ном растворе формалина. Сухой лиофилизированный препарат — высушенная в вакууме 10% взвесь эритроцитов без консерванта. Перед употреблением его разводят в соответствии с указаниями на этикетке. Для постановки реакции в полистироловых пластинах оба препарата применяют в 2,5%-ной концентрации, а при постановке реакции в микрообъемах — в 0,5%-ной концентрации. Гемагглютинационный титр сыворотки учитывают по последнему ее разведению, которое дало вполне четкую реакцию (не менее трех плюсов).

Диагностическим титром считается разведение 1:100 и выше, однако, так же как и в случае РА, необходимо проследить за его нарастанием.

Читайте также:  Что должна делать девочка в 13 лет

РНГА при туляремии является достаточно специфичной и обнаруживает некоторые перекрестные реакции только с бруцеллезными сыворотками. Дифференциальная диагностика возможна по высоте титров в РНГА, которые значительно выше с гомологичным антигеном.

РНГА может быть выполнена в микрообъемах при помощи микротитратора типа Такачи, который позволяет осуществлять титрование материала в объемах 25 и 50 мкл. Техника постановки реакций, последовательность всех операций такая же, как и при исследовании в полистироловых пластинах. Следует, однако, иметь ввиду, что чувствительность микрометода обычно на одно разведение (т.е. в 2 раза) ниже, чем макрометода.

Специфичность положительного результата, полученного в РНГА, может быть проверена при помощи трехкомпонентной реакции — реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТНГА). Эту реакцию ставят для подтверждения специфичности положительного результата РНГА, когда он вызывает сомнение или представляет особый эпидемиологический интерес. Механизм реакции заключается в специфическом торможении гемагглютинации при добавлении к испытуемой сыворотке взвеси убитых туляремийных бактерий. В реакции взаимодействуют три компонента: испытуемая сыворотка, специфический туляремийный антиген и антигенный эритроцитарный диагностикум.

в) Иммуноферментный анализ на твердом носителе используют для диагностики туляремии у больных и переболевших людей, определения наличия иммунитета у вакцинированных против туляремии. У больных туляремией специфические антитела обнаруживаются в И ФА в промежутке между 6-10-м днями, достигают максимальных показателей к 4-7-й неделе, затем уровень их снижается, но они продолжают выявляться длительное время (более 10 лет после переболевания). ИФА обеспечивает более раннюю (по сравнению с РА и РИГА) и эффективную иммунологическую диагностику. Титры антител у больных и вакцинированных колеблются в значительных пределах от 1:400 до 1:40 000 и выше и, как правило, в 10-20 раз превышают таковые в РА и РНГА.

Для постановки ИФА используют диагностическую тест-систему иммуноферментную для определения туляремийных антител. Выявление туляремийных антител в сыворотках людей происходит за счет специфического взаимодействия антигена возбудителя туляремии, адсорбированного на планшете, с туляремийными антителами в исследуемой сыворотке. Образовавшийся комплекс антиген — антитело определяют при помощи антител против иммуноглобулинов человека, меченных иероксидазой.

В соответствии с назначением тест-система представляет собой набор ингредиентов для проведения иммуноферментного анализа на твердофазном носителе и включает в себя: туляремийный липонолисахарид; антитела против иммуноглобулинов человека, меченных иероксидазой; контрольную положительную сыворотку; контрольную отрицательную сыворотку; набор солей, необходимых для приготовления буферных растворов; субстрат — О-фенилендиамин (ОФД); твин-20; бычий сывороточный альбумин (БСА); планшеты для ИФА однократного применения.

Сыворотки рекомендуется первоначально исследовать параллельно в двух лунках в разведении 1:200 с последующей раститровкой положительных, сывороток, для определения титра антител, используя двукратные разведения. Диагностическим титром в ИФА считают разведение сыворотки 1:400 и выше.

В последние годы для диагностики туляремии разработаны и некоторые другие методы, в частности основанные на использовании синтетических носителей для сенсибилизации антигена, с успехом используемые в отдельных регионах и учреждениях.

г) Непрямой иммунофлуоресцентный метод. Для обнаружения туляремийных антител готовят мазки из 1-2-суточной агаровой культуры возбудителя (взвесь 1 млрд клеток/мл). При этом на одном предметном стекле делают 8 мазков, фиксируют их в этиловом спирте в течение 30 мин, не обжигая высушивают на воздухе и помещают во влажную камеру. Исследуемую сыворотку разводят двукратно до разведений от 1:10 до 1:640-1:1280 и наносят пастеровской пипеткой на мазки, начиная с большего разведения. Влажную камеру с препаратом помещают в термостат при 37°С на 30 мин. Мазок отмывают от несвязавшихся антител и после подсыхания его вновь помещают во влажную камеру, докрашивая антивидовой люминесцирующей сывороткой в рабочем разведении. После просмотра препарата устанавливают титр антител в исследуемой сыворотке.

Контролем служат препараты, в которых туляремийные бактерии обработаны туляремийной сывороткой (положительный контроль) и сывороткой, не содержащей антитела к возбудителю туляремии (отрицательный контроль). При исследовании сыворотки больного с подозрением на туляремию диагностическим считается титр не менее 1:40.

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 30.1.2020

Ссылка на основную публикацию
Сердечно легочную реанимацию необходимо проводить
Сердечно-легочная реанимация (СЛР) - комплекс мероприятий, проводимых на этапе оказания неотложной помощи с целью восстановления жизненно важных функций организма. Начинать...
Семена подорожника в народной медицине
Здравствуйте мои дорогие читатели! Крупное растение, которое очень полезно для здоровья человека. Используйте корнеплоды, листья и рассаду. Теперь поговорим о...
Семечки арбуза польза и вред
Арбузные семечки обычно отправляются вместе с корками в мусорное ведро. Но оказывается, мы выбрасываем очень ценный продукт, который мог бы...
Сердечно сосудистые заболевания код по мкб 10
Сифилис сердечно-сосудистой системы: БДУ (A52.0†) врожденный поздний (A50.5†) Сердечно-сосудистые: нарушения НКДР при болезнях Шагаса (хронический) (B57.2†) поражения при пинте [карате]...
Adblock detector